جدایی دستی قشر پارانشیم و بافت ستونی

قشر پارانشیم

جدایی دستی قشر پارانشیم [1](Cortical Parenchyma) و بافت ستونی (بافت مرتبط در ساقه) در منطقه تمایز ریشه های اولیه ذرت

در جهت طولی ، ریشه اولیه ذرت (شکل A1) را می تواند به مناطق مریستمی (MZ)، کشیدگی (EZ)، و تفکیک (DZ) تقسیم شود. منطقه تفکیک را می توان نسبت به مریستمی و ازدیاد طول مناطق با حضور ریشه موها متمایز کرد ، که لکه بینی این منطقه از ریشه را به راحتی اجازه می دهد. در جهت عرضی، منطقه تفکیک ریشه های ذرت را می توان به به یک ساقه مرکزی تقسیم کرد (شکل 1D، ها)، که شامل آوندها، پارانشیم مغز، و لایه بیرونی  و اطراف بافتهای با زمینهparenchymous  می شود (شکل 1D، CP) ، که از اپیدرم، لایه های متعدد بافت پارانشیم قشری، و داخلی ترین بافت پوسته ریشه و ساقه تشکیل شده است. با توجه به تسلط سلولهای پارانشیم قشری در این منطقه بیرونی ریشه و عدم وجود یک دوره گیاه شناسی کافی، این بافت پس از آن پارانشیم قشری نامیده خواهد شد.

Toluidine[2] آبی، رنگی است که لکه های سلولهای دیواره ای چند رنگه(polychromatic) بسته به ترکیب شیمیایی آنها از خود نشان می دهند (اوبراین و همکاران، 1964) و در نتیجه تمایز ساقه و قشرهای بافت در مرز pericycle و endodermis [3]را اجازه می دهد(شکل 1D).

در محل اتصال بین سلولهای pericycle (PE) و endodermis (EN) (شکل 1G)، ممکن است به صورت مکانیکی (شکل 1، B و C) مناطق بیرونی (شکل 1E، CP) و درونی (شکل 1F ، S) از منطقه تفکیک ریشه بدون آسیب رساندن به سلولهای endodermis (شکل 1H، FA) و یا pericycle (شکل 1I، PE) جدا شوند(نگاه کنید به “مواد و روش ها”). در این مطالعه، ساقه و پارانشیم قشری از منطقه تفکیک ریشه 2.5-D-OLD اصلی خط خالص B73 استفاده شد. در این مرحله ازپیشرفت، ریشه اصلی ذرت خالص  B73 به طور متوسط 21.9±6 میلیمتر طول دارد و طول منطقه تفکیک این ریشه 12.7± 5.9 میلیمتر است. در این مرحله ازپیشرفت، ریشه های جانبی (عرضی) وارد نشده اند، همانگونه که در propidium رنگ آمیزی یدید آماده سازی ساقه (استوانه آوندی) نشان داده شد، در حالی که در آماده سازی ساقه 4-D-OLD (با سن 4 روز)، primordia جانبی به وضوح قابل مشاهده بود (داده ها نشان داده نشده اند). پس از جداسازی مکانیکی بافت درونی و بیرونی منطقه تفکیک ریشه های اولیه ذرت 2.5-D-OLD، این بافتهای عملکردی متنوع در معرض آزمایش پروفایل proteome [4]مقایسه ای – و هورمون- قرار گرفتند.

ایزوله کردن و جدایی 2-DE پروتئین های قشر پارانشیم و بافت ساقه

پروتئین های قابل حل شدن در سه تکرار بیولوژیکی مستقل از قشر پارانشیم و بافت های ساقه ذرت خط همخون B73 ایزوله شدند. تمرکز ایزوالکتریک روی سه عصاره پروتئین در هر بافت در شیب خطی اعم از PH برابر 4 تا 7 انجام شد. پس از آن، این عصاره های پروتئین با توجه به جرم مولکولی شان در یک بعد دوم در ژل 12.5٪ SDS-PAGE جدا شدند. در نهایت، لکه های پروتئین با رنگ آمیزی آبی درخشان کلوئیدی Coomassie[5] مشاهده شدند. در مجموع، 599 نقاط پروتئین مجزا reproducibly (به صورت دوباره تولید شدن) در پارانشیم قشری یا بافت ساقه تشخیص داده شد. تنها پروتئین هایی که در هر سه تکرار شدن بیولوژیکی حداقل یک بافت شناسایی شد بیشتر مورد بررسی قرار گرفتند. در شکل مکمل S1، نمایشگر ژل 2-DE  B73 قشر پارانشیم و ساقه پروتئین نمایش داده شده است. شدت تمام نقاط اندازه گیری به ازای ژل از طریق شبیه سازی کامپیوتر با استفاده از نرم افزار PD-Quest برای جبران کردن تغییرات مربوطه غیر بیانی در شدت نقاط نرمالیزه شده است.

شناسایی پروتئین ها انباشته متفاوت در قشر پارانشیم و ساقه

یکی از اهداف این پژوهش شناسایی پروتئینهایی هستند که ترجیحا در پارانشیم قشری یا بافت ساقه انباشته شده اند. به طور کلی، 70 از 599 پروتئین (12 درصد) تشخیص داده شده در این دو نوع بافت تفاوت تجمع $ 2 را نشان داد و پس از تنظیم مقدار P آزمون t (P 0.01)، کنترل نرخ کشف اشتباه (FDR) در سطح معنی دار 5 درصد مورد توجه قرار گرفت (جداول I و II). از میان 70 پروتئین که به صورت متفاوت در پارانشیم قشری در مقابل عصاره پروتئین ساقه انباشته شده، 59 مورد به طور انحصاری و یا ترجیحی در پارانشیم قشری بیان شد، در حالی که 11 پروتئین به صورت عمده در ساقه (جداول I و II) انباشته شد. تمام 70 نقاط پروتئین ها از نماینده ژل 2-DE برداشت و با تریپسین[6] هضم شد. تجزیه و تحلیل و شناسایی پپتید[7] با استفاده از طیف سنجی جرمی نانو-HPLC-الکترواسپری یونیزاسیون- (ESI-MS / MS) پشت سر هم انجام شد. نرم افزار خودکار MASCOT (علوم ماتریس؛ پرکینز و همکاران، 1999) برای مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی nonredundant (غیر اضافی)(NCBI.nr) پایگاه داده پروتئین که در جستجوی همه پروتئین های گیاهی سطح بالاتر در دسترس می باشد (گیاهان سبز Viridiplantae) استفاده شد. تمامی 70 پروتئین متفاوت انباشته از طریق تجزیه و تحلیل E SI-MS/MS مشخص شد ، به صورت عملی از طریق پایگاه داده NCBI.nr (جداول I و II) با توجه به مرکز اطلاعات مونیخ برای سیستم تفسیر توالی پروتئین شرح داده شد، (http://mips.gsf. De/) و به دسته های مختلف کاربردی طبقه بندی شد. یک لیست از پپتیدهای مشخص شده برای تمام پروتئین در مکمل جدول S1 ارائه شده است.

تجمع ممتاز پروتئین ها و Transcript[8] های  b-Glucosidase در قشر سلول های پارانشیم

تجمع b-Glucosidase که به صورت انباشت ممتاز از  هشت ایزوفرم مختلف در پارانشیم قشری نمایش داده شده در جزئیات بیشتر مورد بررسی قرار گرفت. اول، immunoblots غربی با یک antibody  اختصاصی علیه این آنزیم، تجمع ترجیحی از این پروتئین در پارانشیم قشری در مقابل بافت ساقه را (شکل 2a) تایید کرده است. جالب توجه است، دو باند اصلی در این immunoblot غربی ، که اندازه بین نشانگر 55 و 72 kD واقع شده اند، از لحاظ اندازه با 7 مورد از پروتئین های تفکیک مطابق است. در حالی که بالا و فراوان تر بودن این دو گروه شامل اکثر پروتئین های دارای احتمال زیاد 3، 12، 23، و 24، که از لحاظ اندازه محدوده بین 63.7 و 66 kD تغییر می کند(جدول1) ، باند پایین تر از لحاظ اندازه به ایزوفرم 25، 28، و 34 مطابق است، که در اندازه بین 59.9 و 61.5 kD (Table1) متغیر است.

ایزوفرم 31، که توسط یک ایزوفرم 35.8 کیلو دالتون در شکل مکمل-S1 نشان داده شده است و ممکن است یک محصول خاص تخریبی و یا یکی دیگر از پروتئین ها باشد، به احتمال زیاد در immunoblot غربی توسط یک گروه همراه با نشانگر کمی بالاتر از 34-KD نمایش داده شود. ژن ذرت b-glucosidase یک پروتئین اسید amino-566 که حاوی یک اسید پپتید transit 54-آمینه برای هدف قرار دادن دیسه[9] کد گذاری می شود(Cicek and Esen ، 1999). پروتئین پیش ساز[10] دارای یک جرم 64.2 کیلو دالتون می باشد، در حالی که جرم مونومر[11] بالغ 58.4 کیلو دالتون، که نشان می دهد که هفت مورد از پروتئین های تفکیک b-glucosidase ارائه دهنده پروتئین زودرس و بالغ است. گروهی که به احتمال زیاد با باند بالاتر مطابق است در شکل 2A در حال حاضر می تواند به عنوان قشر خاص در Coomassie ژل Bluestained درخشان از کل عصاره های پروتئین (شکل 2B) تشخیص داده شود. 2-DE  immunoblotsغربی (شکل 2، C و D) نتایج به دست آمده از شناسایی طیف سنجی جرمی پروتئین های خاص پارانشیم قشری (جدول1) و immunoblots یک بعدی غربی (شکل 2a) را تایید می کند. تمام نقاط پروتئینهای تشخیص داده شده توسط یک آنتی بادی B-glucosidasespecific ترجیحا در بافت پارانشیم قشری انباشته شده است. نقاط پروتئین فراوان تر در دو باند عمده در شکل 2A مطابقت دارد، در حالی که نشانگر 35.8-KD توسط نقاط بسیار کم نور کمی بالاتر از نشانگر 34-KD ارائه شده است. نرخهای انباشت mRNA و پروتئین ها به نرخ سنتز و تخریب این مولکول ها بستگی دارد.

بنابراین، تفاوت تجمع پروتئین لزوما با اختلاف transcripts مربوطه بستگی ندارد. برای بررسی اینکه اگر تفاوت تجمع ایزوفرم مختلف b-glucosidase در حال حاضر در سطح RNA آشکار شود، PCR زمان واقعی کمی (qRT-PCR) انجام شد (شکل 2E). سطح Transcript از b-glucosidase بیان بسیار ترجیحی از ژن b-glucosidase در سلولهای پارانشیم قشری را تایید کرده است. B-Glucosidases به طور خاص می تواند با پروتئین های فاکتور تجمعی B- glucosidase (BGAF؛ الحاق در Genbank نوع NM_001111494) برای تشکیل heterocomplexes  با جرم ملکولی زیاد تعامل می کند(بلانچارد و همکاران، 2001). اتصال BGAF به B-گلوکوزیداز بر فعالیت آنزیم تاثیر نمی گذارد و به احتمال زیاد نقش محافظ در برابرآنزیم پروتئاز [12]بازی می کند. در جهتی که با تجمع ترجیحیB-گلوکوزیداز در قشر پارانشیم همراه است، BGAF نیز ترجیحا در آن بافت در مقایسه با ساقه (شکل 2F) بیان شده است.

قشر پارانشیم به ویژه ب گلوکوزیداز که ترجیحا در ریشه و بافت نهال در تقاطع ساقه / ریشه بیان شده اند

پس از نشان دادن اینکه که پروتئین B-گلوکوزیداز و transcriptها به صورت ترجیحی در قشر پارانشیم منطقه تفکیک ریشه انباشته شده اند، ما بیان این ژن را در بافت مختلف 61 ذرت (شکل 3) اندازهگیری کردیم. Massively Parallel Signature Sequencing  [13](MPSS) یک چهار چوب فرم باز که سطح بیان ژن را در بافت با استفاده از شمارش تعداد توالی 17-bp  mRNA  منحصر به فرد در جمعیت 2 3 105-2 3 106 cDNA  مورد تجزیه و تحلیل قرار می­دهد. این  17-bp توالی امضای شده اغلب با cDNA حاصل منحصر به فرد مطابقت دارد، بنابراین برای اندازه گیری فراوانی cDNA مربوط خاص در یک نمونه به نمایندگی از یک عضو خاص و مرحله پیشرفت در یک زمینه ژنتیکی تعریف شده اجازه می دهد (کریستنسن و همکاران، 2003).

حالت ژن B-گلوکوزیداز در تمامی انواع ریشه های تجزیه و تحلیل شده در سطح قابل توجهی مشاهده شد (شکل 3) که در برخی از انواع ریشه ها از 20،000 ppm تجاوز کرده است. سایر ارگان نهال در محل اتصال ریشه / ساقه، از جمله mesocotyl، گره coleoptilar، و ساقه، سطح بیان بسیار بالایی از این ژن را نیز نمایش داده اند ، نشان می دهد که در کولئوپتیل(ساقه)، بیش از 3 درصد از تمامی transcripts (بیش از30،000 پی پی ام) توسط این ژن B-گلوکوزیداز سنتز شدند.

قشر پارانشیم بویژه تجمع آنزیم ها که در جذب آمونیوم شرکت می کنند

توابع مجزا از قشر پارانشیم و بافت ساقه (stele) نه تنها توسط تجمع مختلف پروتئین منحصر به فرد منعکس شده است، بلکه توسط آنزیم های متعددی که متعلق به مسیرهای بیوشیمیایی خاص است نیز منعکس  می شود. در این مطالعه، چهار آنزیم خاص پارانشیم های قشری (آمینوترانسفراز ASP، پروتئین 21؛ سنتتاز Asn ، پروتئین 7؛ Glu دهیدروژناز، پروتئین 9، 33، 40 و 41؛ و سنتتاز GLN، پروتئین 26 و 27)، که توسط هشت نقطه پروتئین ارائه شده اند(شکل 4)، در جذب آمونیوم به اسیدهای آمینه nitrogen-transport  Glu ، GLN، ASP، و Asn درگیر هستند(برای بررسی، ببینید لام و همکاران، 1996).

تفاوت بافت خاص در محتوا هورمون های قشر پارانشیم و ساقه

عمل خاص فیتو هورمونها در رشد، توسعه، و تفکیک ریشه به توزیع بافت خاص دقیق آنها نیاز دارد. در این مطالعه، هورمونهای گیاهی اکسین (IAA)، سیتوکینین، و اسید آبسزیک و حد واسط های و ترکیبات انتخاب شده آن، در یک مد بافت خاص در پارانشیم قشری 2.5-D-قدیمی و ساقه منطقه تمایز ریشه های اولیه ذرت اندازه گیری شده است . این متابولیت از طریق HPLC-ESI-MS / MS با استفاده از استانداردهای داخلی deuterated تحلیل شده است. نتایج حاصل از این بررسی ها در شکل 5 خلاصه شده و در نانوگرم به ازای هر گرم وزن خشک بیان شده است. سیتوکنین های مختلف از پیش سازهای مختلف سنتز شده است. سه سیتوکنین به طور طبیعی بوجود آمده  trans-zeatin, cis-zeatin (c-Z), و  dihydrozeatin می باشند و پیش سازهای آنها به طور گسترده ای در طبیعت یافت میشود(Sakakibara 2006).

CZ و متابولیت های مرتبط با آن سیتوکینین غالب در ذرت است(Veach و همکاران، 2003). در حالی که غلظت trans-Zeatin و dihydrozeatin و پیش سازها و ترکیبات آنها زیر حد تعیین بودند، CZ (برابر تغییر = 4.5)، پیش ساز آن riboside C-Z (برابر تغییر = 6.1) و هم اتحادی های آن O-گلوکوزید cis-zeatin O-glucoside (C-ZOG، برابر تغییر = 2.7) ترجیحا در پارانشیم قشری در مقابل بافت ساقه انباشته شد (شکل 5A). پیش ساز riboside CZ در یک غلظت بالاتر از CZ نمایش داده می شود. قابل ذکر است، بسیاری از سیتوکینین شناسایی شده در منطقه تفکیک ریشه های اولیه ذرت 2.5-D-DAY در حال حاضر در فرم هم اتحادی[14] C-ZOG ارائه شده اند، که می تواند به صورت برگشت پذیر به CZ توسط b-گلوکوزیداز منتقل شود. اکسین IAA  در 2.3 بار تجمع بالاتر در ساقه در برابر بافت پارانشیم قشری (شکل 5B) نمایش داده می شود. به طور مشابه، IAA غیر فعال متحد شده با اسید آمینه Asp 2.3 برابر بیشتر در ساقه در مقابل بافت پارانشیم قشری (شکل 5B) انباشته شد.

IAA متحد شده با سایر اسیدهای آمینه زیر حد تعیین شده (ALA، Glu) و یا تشخیصی (LEU) بود. مقدار IAA آزاد در ساقه 18.8 برابر بیشتر از فراوان ترین فرم غیر فعال IAA آن متحد شده با یک اسید آمینه (IAA-ASP) بود. برای اسید آبسزیک، هیچ تفاوت معنی داری بین غلظت پارانشیم قشری و ساقه (شکل 5C) مشاهده نشد.

[1] گیاه شناسی. بافت اساسی از گیاهان، متشکل از سلولهای نازک دیواری قادر به تقسیم.

[2] هر یک از سه آمین ایزومریک داشتن فرمول C 7 H 9 N، مشتق شده از تولوئن: مورد استفاده در صنایع رنگ و مواد مخدر است.

[3] بافت تخصصی در ریشه و ساقه گیاهان آوندی، متشکل از یک لایه از سلولهای پارانشیم اصلاح شده تشکیل مرز درونی از قشر.

[4] کل مکمل پروتئین در یک موجود زنده در کل چرخه زندگی خود و یا در یک نوع سلول خاص در یک زمان خاص تحت شرایط محیطی تعریف شده پیدا شده است،.

[5] برای استفاده در صنعت نساجی توسعه داده شد اما در حال حاضر معمولا برای رنگ آمیزی پروتئین در بیوشیمی تحلیلی استفاده می شود.

[6] آنزيمي از پانکراس که پروتئينهاي موجود در روده باريک را تجزيه مي کند .

[7] یک ترکیب حاوی دو یا چند اسید آمینه است که در آن گروه کربوکسیل یک اسید با گروه آمینه دیگری مرتبط است.

[8] یک کپی دقیق و یا تولید مثل، به خصوص داشتن یک جایگاه رسمی

[9] به عنوان کلروپلاست، و حاوی ریبوزوم، DNA پروکاریوتی، و، اغلب، رنگدانه. plastid

[10] precursor

[11] یک مولکول با وزن مولکولی پایین قادر به واکنش با مولکول یکسان یا متفاوت از وزن مولکولی کم به شکل یک پلیمر.

[12] هر گروهی از آنزیم ها که تخریب هیدرولیتیک پروتئین یا پلی پپتید به پلیمر اسید آمینه کوچکتر را کاتالیز می کنند.

[13] انجمن تعیین توالی توازن انبوه

[14] conjugated

No votes yet.
Please wait...